褪黑素治疗创伤性脑损伤的研究进展

　　摘    要：创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）是由外力引起的大脑结构和生理功能破坏的损伤性疾病，包括原发性和继发性脑损伤。原发性脑损伤现阶段无法通过临床治疗手段来干预其发生、发展和预后；现有证据表明，继发性脑损伤致病机制包括氧化应激、炎症反应、神经兴奋性毒性、钙离子超载、细胞凋亡、线粒体自噬等一系列应激调控反应。褪黑素具有抗炎、抗氧化、抗凋亡以及提高自噬水平的治疗作用，具有透过血脑屏障和细胞膜的能力。本文重点讨论褪黑素在TBI中的保护作用机制，为TBI的临床治疗寻找新的研究方向。

　　关键词:创伤性脑损伤;褪黑素;氧化应激;炎症反应;细胞凋亡;线粒体自噬;神经元再生;

　　创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）是重要的公共卫生问题，具有高发病率、高致残率和高死亡率的特点。其发生是由于大脑突然受到打击或震动、破坏了脑正常功能而引起。TBI最常见的病因包括接触性运动、车祸、家庭暴力或战争伤害[1]，总体预后较差，死亡率在10%~70%之间，长期发病率显著[2]，给社会造成了重大负担。虽然神经外科和重症监护治疗有所改善，但严重TBI患者的死亡率仍然很高，目前缺乏对TBI有效的综合治疗策略和治疗药物。

　　褪黑素主要是由哺乳动物和人类松果体产生的一种胺类激素，前体是色氨酸，其合成受昼夜周期及交感神经的影响。在血浆及脑脊液中褪黑素水平呈现昼夜节律性，在夜间分泌水平较高，具有促进睡眠、调节时差、抗衰老、调节免疫、调节内分泌节律、抑制肿瘤生长等多项生理功能，并且褪黑素具有强大的抗氧化活性以及其在各种组织再生中发挥作用，包括神经系统、肝脏、骨骼、肾脏、膀胱、皮肤和肌肉等[3]。褪黑素的代谢主要在肝脏和脑进行，代谢产物主要由肾脏排出，人体补充外源性褪黑素后几小时即降至正常生理水平，不会造成褪黑素及其代谢产物的蓄积。

　　褪黑素的生理作用是由三种膜受体（MT1、MT2和MT3）介导的[4]。MT1和MT2主要分布在啮齿动物的大脑区域神经系统，包括视交叉上核、小脑、丘脑、海马体和周围组织[5]。褪黑素在临床上主要用于调节昼夜节律和诱导睡眠，目前研究发现褪黑素有强大的抗氧化、抑制炎症以及可以透过血脑屏障和细胞膜等生理作用，并且褪黑素的亲脂性使它能够很容易穿过细胞膜并到达亚细胞隔室[6]，使TBI广泛的反应过程中断，如代谢级联反应、不加区分的神经递质释放、氧化应激和线粒体功能障碍等，Campolo等[7]和Kelso等[8]采用褪黑素和地塞米松、二甲胺四环素联合治疗TBI，目前在TBI动物模型中取得疗效。Rui等[9]最新研究发现褪黑素通过抑制铁蛋白重链介导的铁下垂来治疗TBI，可以改善TBI后认知功能[10]。褪黑素可能在多个发生发展阶段对TBI产生治疗作用。

　　1 褪黑素在TBI中抑制氧化应激作用

　　活性氧诱导的氧化应激反应可能参与了继发性脑损伤的病理生理过程，并且加剧原发性脑损伤，TBI后通过巨噬细胞吞噬损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns molecules，DAMPs）导致溶酶体损伤，释放溶酶体化合物，致使活性氧水平升高[11]。褪黑素及其代谢产物是一种广谱抗氧化剂和非常有效的自由基清除剂，它可与自由基直接反应发挥作用[12]，也可以通过相应的通道蛋白减少活性氧的生成与激活，可能与瞬时受体电位(melastatin- like transient receptor potential 2，TRP) M2通路和核转录相关因子（NF-E2-related factor 2，Nrf2）通路相关。

　　1.1 TRPM2通路

　　TRPM2是一种钙离子渗透性非选择性通道[13]，功能性的TRPM2通道主要集中在海马、皮层和纹状体等神经元密布的部位，这些部位容易受到TBI引起的氧化应激损伤[14]。褪黑素对活性氧的抑制作用主要通过调节TRPM2通道来减少钙离子内流。Yürüker等[12]研究表明，创伤性脑损伤后细胞内Ca2+和活性氧水平升高，主要是由退化海马神经元产生，给予褪黑素治疗后通过抑制TRPM2通道激活减少Ca2+内流，使TBI大鼠海马神经元细胞内活性氧的产生减少，抑制TBI后氧化应激反应。研究结果显示应用褪黑素治疗后对TRPM2通道呈现负性调节作用，通过TRPM2通道抑制氧化应激、细胞凋亡和Ca2+内流，从而产生神经保护作用。TRPM2通道之前已经被发现与其他神经退行性疾病有关，此通道的激活是TBI的一个潜在的重要机制，褪黑激素可以通过TRPM2通路在氧化应激中恢复促氧化系统和抗氧化系统之间的平衡，对TBI产生保护作用。

　　1.2 Nrf2通路

　　核转录相关因子Nrf2可诱导内源性抗氧化酶的产生，Nrf2通路是一种多脏器保护途径，在多种脑疾病中具有神经保护作用，包括TBI [15]。在氧化应激或损伤的条件下，Nrf2从Keap1-Nrf2复合物中释放并转移到细胞核中，在细胞核激活Nrf2通路[16]，进一步激活氧化应激反应。在Wang等[17]的研究中，使用Ramelteon（褪黑素受体激动剂）在TBI小鼠中增加核转录相关因子Nrf2的积累量，增加下游蛋白的表达，包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase-1，SOD-1），从而降低氧化应激水平。因此，在TBI中使用Ramelteon治疗可以通过增强Nrf2的表达来抑制氧化应激反应，从而产生脑保护作用。

　　Dehghan等[18]研究发现褪黑素可显著降低脑水肿、血脑屏障通透性和TBI后72 h的颅内压，这些效应可能是由于抑制氧化应激所致，但机制尚不明确。在已有的研究证据中，发现褪黑素调节TBI中的氧化应激反应是多环节、多机制的病理生理过程。氧化应激在TBI中处于中心环节，理论上阻断氧化应激过程的任何环节都能在TBI中发挥治疗作用，抑制氧化应激反应对治疗TBI是有效的[19]。褪黑素作为自由基清除剂，可直接清除创伤脑损伤中的活性氧，从中心环节直接抑制氧化应激反应，从源头阻断氧化应激反应，达到TBI的治疗和保护作用。

　　2 褪黑素在TBI中的抗炎作用

　　Bao等[20]研究发现抑制细胞死亡是神经保护和预防相关炎症反应的关键。当TBI发生时，肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）激活受体相互作用蛋白1（receptor- interactions protein 1，RIP1）被招募形成一种称为坏死体的复合物，坏死体的形成是细胞坏死和促进炎症的必要条件[21]。TNF介导的炎症反应是通过肿瘤坏死因子受体相关因子（TNF receptor-associated factor，TRAF）调节[21]。TRAF是一种信号适配器蛋白，可将上游的受体与下游的适配器蛋白和效应酶连接起来，这是由C端TRAF结构域介导的。同时TRAF受体信号可诱导激活经典和非经典核因子κB信号通路以及激活腺苷酸激活蛋白激酶（5’AMP-activated protein kinase，AMPK）信号通路。

　　2.1 NF-κB通路

　　在TBI后，血清中TNF和细胞膜上TNFR1的表达水平显著上升，当TNF被TNFR1识别时，TRAF即被招集，形成包含细胞凋亡抑制蛋白（cellular inhibitor of apoptosis proteins，cIAP）和RIP1的信号复合物[22]。RIP1是由cIAP泛素化产生，肿瘤坏死因子α诱导蛋白3（tumor necrosis factor-alpha-induced protein 3，TNFAIP3）是一种可以通过泛素编辑来修饰底物多泛素化的替代分子，这是炎症反应的主要机制[23]。Bao等[20]研究发现在TBI中TNFAIP3可以通过抑制核因子κB和炎症因子如IL-6、IL-1β以及NLRP3炎性小体的表达，来抑制炎症反应。研究结果表明，TNFAIP3是调节和控制TBI后的坏死和炎症是必不可少的，TBI后缺乏TNFAIP3会导致侵袭性坏死，并减弱褪黑激素的抗坏死和抗炎作用。与Zhong等[23]相关研究结果一致，本课题组通过C57小鼠建立TBI模型，术后即刻开始腹腔注射褪黑素，观察对照组和实验组炎症蛋白的表达水平，目前的研究结果显示褪黑素在TBI模型中可以直接抑制核因子κB和磷酸化核因子κB（phosphory- lation nuclear factor kappa-B，p-NF-κB）的表达，从而抑制炎症因子IL-1β和IL-8和NLRP3等的表达水平，抑制炎症反应。Onizawa等[24]的研究将核因子κB和RIPK3泛素化联系起来，提出了TNFAIP3可能预防炎症性疾病的创新机制。

　　2.2 AMPK通路

　　AMPK是一种重要的细胞内能量传感器，深入参与能量代谢。AMPK的激活抑制了腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）的消耗，对氧化应激和细胞炎症提供保护作用[25]。AMPK磷酸化在颅脑疾病的不同模型中具有潜在的保护作用[26]。环磷腺苷效应元件（CAMP-response element-binding，CREB）蛋白是一种著名的促生存蛋白，由AMPK家族成员蛋白控制，已有研究表明CREB的磷酸化通过调节p-NF-κB进一步阻断炎症介质的转录来降低神经炎症反应[27]。Rehman等[28]发现褪黑素治疗TBI具有神经保护作用，减少神经炎症和神经变性。研究显示TBI小鼠大脑中的p-AMPK水平和p-CREB水平和p-NF-κB水平升高，而给予褪黑激素治疗后可显著降低TBI小鼠大脑中的p-AMPK、p-CREB和p-NF-κB的表达水平。这些研究显示TBI诱导脑能量供需不平衡，降低神经细胞的生存率，而褪黑素治疗可通过调节p-AMPK/ p- CREB信号通路来克服能量消耗，减少神经炎症反应，降低TBI后的神经损伤和神经变性。在Ding等[29]研究中发现哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物（mechanistic target of rapamycin complex，mTOR）途径可能参与褪黑素抑制TBI的炎症反应，研究发现褪黑素可明显抑制小胶质细胞激活、减少原始炎症细胞因子的释放和增加周围挫伤部位存活神经元数量。结果显示褪黑素的使用导致mTOR磷酸化，对神经炎症产生抑制作用。与氧化应激反应的过程相同，炎症反应也是TBI中不可避免的重要病理生理过程。已有证据显示，抑制TBI后的炎症反应，可以改善继发性脑损伤。

　　3褪黑素在TBI中对皮质神经元再生的影响

　　研究表明TBI可以刺激内源性神经干细胞的增殖，但是激活的内源性神经干细胞在受损的皮质中不能转化为成熟的神经元[30]。有研究发现褪黑素可促进急性肾损伤后的肾再生，并且提示褪黑素可以促进施万细胞的增殖和迁移，从而促进周围神经再生[31]。褪黑素在TBI中是否能促进神经元再生及神经元分化的相关研究目前比较少，Ge等[32]通过免疫荧光和末端脱氧核苷酸转移酶dUTP末端标记法观察新生神经元和凋亡细胞，结果显示新生的未成熟神经元出现在损伤皮层，而新生的成熟神经元仅出现在TBI+褪黑素组。这表明TBI后损伤皮层形成新生神经元，而褪黑素促进了损伤皮层未成熟神经元向成熟神经元分化。证明褪黑素可促进TBI后损伤皮层神经元再生，改善认知功能恢复。褪黑素对受损皮层神经元分化的影响可能与调节细胞骨架组织的激素吲哚环的功能有关，细胞骨架组织可能与未成熟神经元的树突成熟或与神经元迁移有关，以及与抗氧化和抗凋亡能力相关。褪黑素促进神经元再生在TBI中具有神经保护作用，可能会成为TBI治疗前景和新关注点。但是，目前仅在动物模型实验中观察到此结果，相关文献报道还较少，未来需要更多临床研究来实践。

　　4褪黑素在TBI患者中调节线粒体自噬的作用

　　线粒体是一种高度动态的超结构和产生能量的细胞器，与多种疾病相关，在一般情况下，神经元中线粒体的总数是通过分解和融合机制来维持动态平衡。Cui等[33]研究发现阻断继发性损伤的生化过程和细胞事件，如线粒体自噬，是改善神经损伤预后的关键。线粒体在TBI中具有兴奋性毒性，最近的研究发现线粒体紊乱可导致继发性神经元损伤和脑创伤死亡[34]。Salman等[35]研究发现，褪黑素治疗可显著减少线粒体分裂，促进线粒体融合和促进线粒体膜电位的恢复和氧化磷酸化，减少了细胞色素c的释放；研究还发现褪黑素治疗显著抑制TBI大鼠凋亡相关因子样蛋白（Bcl-2-Like Protein，Bax）和线粒体动力相关蛋白（dynamin-related protein 1，DRP1）向线粒体的易位，并且线粒体超微结构分析显示了线粒体融合机制的激活，可能是褪黑素通过上调过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子1α蛋白（α subunit of peroxisome proliferators-activated receptor-γcoactivator- 1，PGC-1α）促进线粒体融合，支持褪黑素对TBI大鼠的治疗作用。结果显示褪黑素在改善TBI大鼠的线粒体功能障碍方面的补救作用，并为线粒体介导的神经保护提供了支持，成为TBI后一种可能的治疗方法。DRP1是促进线粒体融合的重要蛋白，褪黑素可以抑制DRP1介导的线粒体分裂，从而对TBI产生治疗作用。

　　Lin等[36]研究表明，抑制有丝分裂，选择性降解受损的线粒体自噬，可明显增强炎症诱导的TBI，给予褪黑素治疗后通过mTOR途径激活有丝分裂，减轻TBI诱导的炎症。研究结果显示褪黑素治疗可通过增强线粒体自噬清除受损线粒体，显著改善TBI后神经元死亡和行为缺陷，而自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）则通过抑制有丝分裂来逆转这一效应，进一步说明自噬在TBI中的保护作用。Ding等[36]采用免疫荧光法测定自噬标记，即Beclin-1和微管相关蛋白1轻链3-II（microtubule associated protein 1 light chain 3-II，LC3-II），结果显示3-MA对线粒体自噬有抑制作用，而褪黑激素增强了TBI后线粒体的自噬能力，并伴随Bax到线粒体的转移减少和细胞色素C释放到细胞质减少。以上证明褪黑激素的治疗可以增强小鼠TBI后的自噬能力，抑制线粒体凋亡途径，从而保护小鼠在TBI后免受继发性脑损伤。因此，褪黑素促进线粒体自噬可能是通过mTOR途径激活，促进线粒体融合，抑制有丝分裂，负调控TBI中的炎症因子分泌，从而产生TBI的保护作用。

　　综上所述，褪黑素在TBI的治疗作用一方面是抑制氧化应激、炎症反应、细胞凋亡及线粒体自噬等细胞反应，减少创伤后神经系统损伤；另一方面，促进神经元的再生以及受损神经元的修复，促进神经功能修复。TBI的继发性损伤是多种因素共同导致的复杂级联反应，联合治疗可能是一种有效治疗手段和方向。深入研究褪黑素在TBI中的治疗作用机制及通过联合治疗手段来阻断TBI后继发性损伤的发生、发展等方面将为临床治疗提供新思路和策略。

　　[编辑] 郭 欣

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