风热感冒临床表型组及药物表型组的构建与表型组学研究

摘    要：随着中医药现代化的深入发展，新兴科学表型组学（phenomics）已成为传统中医药融合现代医学的新研究范式。本文提出以中医证候为框架，结合现代医学对证候相关临床表型特征的共识，构建风热感冒临床表型组，并根据方证相应原则，建立大型“病证方”相结合的风热感冒临床表型组及银翘散药物表型组队列，进行多组学集合的表型组学研究的理论和方法。为中医证候的量化诊断和治疗以及临床疗效评价提供客观科学依据，最终实现风热感冒的精准防治。

关键词:表型组学;风热感冒;银翘散;中医药;代谢组学;精准医学;

Clinical Phenome and Pharmacophenome of Fengre(风热) Cold

LIU Ziyu GAO Chenhao Lingyu Linda YE Dayue Darrel DUAN

The Affliated Traditional Chinese Medicine Hospital of Southwest Medical University Center

for Phenomics of Traditional Chinese Medicine, Southwest Medical University

Abstract：Amid the modernization of traditional Chinese medicine (TCM), the emerging phenomics has become a new paradigm for the integration of TCM with western medicine. This study described how to construct a clinical phenome of Fengre (风热) cold (FRC) based on the TCM syndrome and the syndrome-related phenotypic characteristics in western medicine. In addition, a large phenomic cohort of clinical FRC phenome and Yinqiaosan (银翘散) pharmacophenome was established according to the TCM principle of prescription corresponding with syndrome. The phenomics of these cohorts with integrated multi-omic approaches may lay a scientific basis for the quantitative diagnosis and treatment of TCM syndrome and the evaluation of clinical efficacy and ultimately precise prevention and treatment of FRC.

Keyword：Phenomics; Fengre(风热) cold; Yinqiaosan(银翘散); TCM; Metabonomics; Precision medicine;

1. 表型组学——研究中医证候的新范式

中医是最早最系统地观察、记录和分析人体生理、病理、心理、行为和药物反应等多种不同临床表型的科学。随着现代科技的进步和发展，中医学借助现代检测手段，认识的各类临床表型由整体层面向分子层面深入展开[1]，因此，可以观测到的用于辨证施治的临床表型与证据也随之增加，如今，对表型组的研究[2]已经成为传统中医药融入现代医学的关键切入点。

由于临床表型组（clinical phenome）具有表型的层次多样性（症状表现水平及相应的基因水平、转录水平、生化水平等）、时空差异性和环境因素多变性，因此，建立在以解剖系统和器官甚至分子表型基础上认识疾病的现代西医学，即使在获得了这些十分详尽的数据信息后，却仍然缺乏定义临床表型组的理论和临床依据，无从开展具有理论指导和临床验证的临床表型组学研究。而建立在以整体观和辨证论治理论基础上的传统中医药学，以证候定义临床疾病并进行分类治疗，正好就是临床表型组学的具体应用。因为证候是对疾病当前发展阶段病因、病性、病位、病势的综合表现和概括，反映出疾病过程中当前阶段的病理变化的本质。也就是说，证候就是临床表型组。因此，我们认为，以中医证候作为定义临床表型组的框架，结合现代西医学对证候相关的表型的共识以及生物医学检验技术及影像学结果等来确定临床表型组，就可以解决现代西医学定义临床表型组的难题，开辟临床表型组学研究新领域。

1.1 表型组学的基本概念

随着后基因组时代功能性基因组学(functional genomics)和功能性蛋白质组学(Functional proteomics)以及全基因组关联研究(Genome-wide Association Study，GWAS)的快速发展，催生了表型组学(phenomics)这一门新兴科学[3,4,5]。

自2000年人类基因组测序工程顺利完成后，人们开始了以基因组的变化来诠释临床疾病的分子机制。虽然基因组学和功能性基因组学的研究可以找到具体的疾病基因(disease gene)，而且可精确到该基因的单核苷酸变异(SNPs)及其编码的蛋白质表达水平上的变化，但是，基因组学研究一方面并不能提供有关蛋白质的具体表达水平、蛋白质之间的相互作用、翻译后的蛋白质修饰等信息；另一方面不能把基因组内的具体疾病基因与每个个体的具体临床表型(病)相关联，单独用基因组学或蛋白质组学方法都不能对生理、病理和疾病进行全面的、整体的研究和理解。我们一贯认为简单的“钥匙”(基因)与简单的“锁”(表型）之间的匹配关系因为对“钥匙”的认知变得越来越复杂，对“锁”的认知也变得越来越不可确定。因此，人们开始意识到除了在基因组和蛋白质组水平上对“钥匙”的认识要继续深度研究以外，对于“锁”的认识也应该上升到组学的层面。表型组学（phenomics）因此应运而生了。

表型(phenotype)是指由一个种系(species)、生物体(organism)、器官（organ）、组织（tissue）或细胞（cell）所表现的生命运动或功能特征。表型组(phenome)是由基因组(genome)和环境影响等所共同决定的所有表型特征的整体总和。表型组学则是研究表型组的本质特性和其形成的分子机制，尤其是表型组与整个基因组、表观基因组、蛋白质组、相互作用组、代谢组、微生物组等之间在一定外部环境之下的动态关系，分析各个“组”在不同的环境因素（时间、地点、健康与疾病等状态）下对应的功能，主要聚焦于生物体各种环境中各表现型特征（表型组）的高通量测定与解析，从而揭示与表型组密切相关的未知基因和蛋白质成分和形成表型组（或功能）的机制。

1.2 传统中医学与表型组学的共性

中医整体观念[6]认为：人体自身、人与天地皆为整体，疾病的发病并非由单一因素造成，所谓“正气内存，邪不可干”，疾病发病皆因天之邪气（外因）与人体内邪（内因）共同导致。证候[7]是指通过望、闻、问、切四诊所获知对疾病状态某一特定时期的病位、病性等作出的总结，是人体对病原学的反映，是疾病当前本质的反映，具有阶段性、动态性。而且形成表型组的代谢组和微生物组等变化或失调则是某段时间内受到内外环境变化的共同影响产生动态变化而引起的不同的表型组特征，也具有阶段性和动态性。因此，中医的证候实际上就是一个临床表型组[8]；而方剂则是药物表型组。表型组学正好能从理论和技术上揭示中医证候实质的分子机制和应用方剂治疗的机制，所以，临床表型组学和药物表型组学是研究证候和方剂以及辨证论治原理的最切实、最合理的新范式[9]。

2、风热感冒临床表型组与药物表型组

2.1风热感冒临床表型组研究

感冒（cold）是常见的外感疾病之一。如上所述，临床表型组具有层次多样性，即在基因水平、转录水平、生化水平、临床症状表现水平都有着不同的表型特征，并且随着时间和空间的变化，相关表型也在发生变化，而这些特征可以利用证候定义和分类，只针对感冒的不同证候（如风热犯卫证）阶段进行表型组学研究。

风热感冒是感冒的常见中医证候[10]，依据目前流行病学调查显示，普通感冒（common cold）、流行性感冒（flu，流感）均以风热犯卫证为常见或主要证型之一，故以风热感冒作为本研究的范例。

参照《中医内科学》[10]与中华人民共和国中医药行业标准《中医内科病证诊断疗效标准》(ZY/T001.1-94)[11]中普通感冒的诊断依据、证候分类以及《2020版流行性感冒诊疗方案》[12]，总结出风热感冒的主症：发热，恶风，咽干甚则咽痛。次症：鼻塞，流浊涕，鼻窍干热，口干口渴，咽痒，咳嗽。舌脉：舌尖红，舌苔薄白或薄黄，脉浮或浮数。

纳入风热感冒临床表型组的表型在症状表现水平（宏观视角）可见：（1）恶风或见发热；（2）鼻塞、流浊涕或鼻窍干热；（3）头昏、胀甚至头痛，或肢体酸楚；（4）口干甚则口渴；（5）咽干甚则咽痛；（6）舌尖红，或舌苔薄白干或薄黄，或脉浮数等表型。

在生化、影像水平（中观视角）可能有但不限于此的表型：病原学检查：呼吸道病毒检测可明确感染的病毒类型；血液生化检查：（1）血常规提示白细胞计数正常或偏低。（2）中性粒细胞百分率正常或下降。（3）淋巴细胞百分率正常或升高。（4）胸片检查一般提示正常。

在基因、转录水平（微观视角）的表型目前还不清楚，这也是中医药表型组学研究的方向，目前可以利用多组学技术、高通量分析平台进行表型组-代谢组-转录组-基因组的深入研究，即顶部向下的研究，从而发现与宏观表型组相关联的微观表型组，找到与表型变化相关的特异性物质，进而反向验证疾病证候的宏观表型，为中医证候量化提供客观依据。

2.2 药物表型组学及银翘散药物表型组

2.2.1药物表型组学与方剂组学的基本概念

药物表型组学（pharmacophenomics）[13]是通过分析药物的表型组特性，在系统生物学水平上寻找相应的治疗靶标组，并将其与代谢组学、蛋白质组学和药物基因组学结合起来，从表型-基因型到有系统的表型组-基因组，并通过药物反映和治疗靶标来改善药物的临床试验，为临床药物的表型组和分子生物学的发展奠定基础[14,15]，因此，药物表型组学可以为研究中药方剂的作用和临床疗效评价提供新的研究范式。

由于中药复方多成分的特殊性，与机体之间的交互作用十分复杂，而传统的分子生物学以单一路径和目标作为研究对象，往往很难将其作用机制完全解释清楚，从而形成一个“卡脖子”的难题，制约着中医药的科学发展和新药开发[16]。近几年，中医药应用组学研究方法，取得了很多科研成就，并且从一个崭新的角度展现了中医药综合调态的优越性。例如方剂组学（Fangjiomics）[17]，与传统的“组学”技术不同，它通过系统整合基因组、蛋白质组和代谢组相互作用的组学数据，确保患者在正确的剂量、正确的时间接受正确的治疗，以求最大疗效、最小副作用。

中药复方的效应是中药有效分子组合对机体生物分子网络进行广泛调节的综合结果，包括中药复方的药效、次要治疗效果、相互协同作用、毒性、副作用，并将考虑个体在基因、环境和生活方式方面的差异，系统性地确定对应于定义明确的疾病表型组的综合性药物靶标群（图1）。

2.2.2银翘散药物表型组研究

治疗风热感冒的方剂众多，但银翘散在临床中应用最为广泛，疗效显著，它出自于清代吴鞠通所著的《温病条辨》[18]一书，是治疗风热感冒的代表方剂，银翘散是由金银花，连翘，淡竹叶、荆芥，牛蒡子，淡豆豉，薄荷，桔梗，芦根，甘草这几味药物组成，具有辛凉透表、清热解毒功效[19]。此方对风温初起、风温、温热病均有显著疗效，自清朝至今仍有应用。现代药理研究证明银翘散方具有消炎止痛、预防过敏、杀灭细菌、抑制病毒等功效[20,21]。在2015版的《普通感冒中医诊疗指南》[22]中对感冒（风热证）推荐使用银翘散合桑菊饮；在2020版的《流行性感冒诊疗指南》[12]中感冒（风热犯卫证）也推荐使用银翘散。王天琪等[23] 经检索全国专利网，共检索到164篇治疗感冒-风热证的中成药和中药方剂组方，51种药物使用频率超过10次，甘草、防风、连翘、薄荷、金银花排在前五，而这五位药也是银翘散的主要成分，可见银翘散治疗风热感冒临床应用广泛。陶 悦等[24]使用分子对接方法，从分子水平阐明了银翘散复方可能的分子作用区域，再使用网络药理学方法对银翘散的成分、靶点蛋白、生物学功能、通路进行系统研究，为银翘散复方治疗流感病毒提供理论支持。马丽萍[25]通过收治的80例急性上呼吸道感染患者，采用随机数字法将其分为实验组与对照组，对照组采用常规西药治疗，实验组在对照组基础上增加银翘散进行治疗，结果采用银翘散对患有急性上呼吸道感染患者进行治疗，患者的流涕、鼻塞以及咽喉肿痛等症状得到显著缓解，并且能够提高患者的治疗效果，有效缩短患者的恢复时间。王逸凡[26]发现银翘散可通过抑制中性粒细胞胞外诱捕网形成中MPO和CitH3的表达水平，从而减轻小鼠急性肺损伤。廖陈[27]运用网络药理学预测银翘散主要作用于IL-6、TP53、MAPK1、TNF等核心靶点,通过抗炎、抗病毒和调节免疫等相关通路来发挥治疗上呼吸道感染的作用。

当前对中药方剂的研究仍停留在单一靶点对应单一表型的阶段，中药复方对于疾病状态的作用模式却是靶点群对表型组的复杂网络式调节，因此，可以通过建立风热感冒临床表型组队列，对符合条件的风热感冒患者使用银翘散，采集用药前后患者血清、唾液等代谢物并比较差异代谢物，通过搜索数据库获取银翘散治疗风热感冒的活性成分及靶点,利用高效液相色谱技术对复方中的活性成分进行验证,利用药物代谢组学(pharmacometabolomics)、网络药理学及生物信息学等技术，分析参与药理作用的所有生物分子表达谱，通过比较用药前后组间的差异，在系统生物学水平找到银翘散的治疗靶点群和作用机理，阐明银翘散治疗风热感冒的内在原理，进而发现通过君臣佐使药物配伍后，机体某些内在代谢变化与外在症候群之间的潜在联系，即顶部向下与底部向上相结合，为理解银翘散中君臣佐使各成分的作用靶点（群）和配伍作用机理开创新的思维路径与研究模式。

3、代谢组学在研究风热感冒临床表型组和药物表型组中的应用

代谢组学（Metabolomics）[28]是系统生物学的重要组成部分，通过先进的检验技术和算法等对代谢产物进行定量分析，探讨代谢产物及其生理和病理变化之间的联系，其研究对象多是分子量在1000以内的小分子物质，它也是研究表型组分子机制的重要途径，可以准确的识别和量化相对于表型组的机体在不同条件下或不同疾病的发生发展变化过程中的代谢物分子机制。

证候是一个“动态时空”和“多维界面”的复杂系统，只有采用与证候复杂性相适应的思维方式才能揭示其科学内涵，而代谢组学聚焦机体代谢产物的整体变化情况,根据代谢产物推测机体内部已经发生的变化，这与中医学的“整体观、司外揣内”思维模式是相契合的[29]。因此，运用代谢组学方法进行中医证候为框架的临床表型组研究，在辨证分型、证候物质基础、证候代谢途径和证候药效研究等方面有着重要作用[30]。因此，利用代谢组学技术研究风热感冒临床表型组和药物表型组，将有助于揭示风热感冒表型组的本质，可以把找到的差异代谢物作为疾病诊断的生物标志物，并且可以确定中药治疗的药物靶点，为感冒的精准诊断和治疗以及疗效评价提供科学依据（图2）。

4、问题和挑战

首先，在当前阶段，有关中医药的组学研究已然成为热点论题，但对于风热感冒和表型组相结合进行的研究还处在初步探索时期，道阻且长，研究难度大；其次，不管是什么证候，都缺乏标准化的中医证候客观评价标准，难以得到国际认可，因此建立科学、规范的中医证候评价体系势在必行；最后，详细的表型、暴露和健康结果评估是任何纵向队列研究的关键[31]，目前中医表型组的研究主要是针对特定时间点的数据，因此，本研究将计划进行基于纵向人群队列（longitudinal cohort）长时间的跟踪随访，以建立更符合中医特色的表型组研究数据库，为中医证候的量化诊断和治疗以及临床疗效评价提供客观科学依据，最终实现风热感冒的精准防治。

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