基于色泽和化学成分的野菊花种质资源评价

摘    要：探索野菊花外观色泽与内在化学成分之间的关系，为优质野菊花药材采购及优良品种的高效、快速选育提供参考。利用测色仪和超高效液相色谱仪（UPLC）分别测定84份不同种质野菊花样品色泽（明暗色度值L*、红绿色度值a*、黄蓝色度值b*）和化学成分（木犀草苷、蒙花苷、木犀草素、芹菜素、绿原酸），对其进行多样性分析、相关性分析、回归分析和聚类分析。结果显示，野菊花色泽和化学成分具丰富的遗传多样性；绿原酸与L*、b*呈显著正相关，与a*呈显著负相关，木犀草苷和化学成分的相对关联度γi分别与b*、L*呈显著正相关，可根据L*和b*预测木犀草苷、绿原酸含量及γi；蒙花苷、木犀草素、芹菜素与色度值L*、a*、b*无显著相关性；84份野菊种质可聚为4类群，第Ⅲ类群γi和总色度值E*ab优于其他类群，表现为品质和色泽优良，从中筛选出一个品质最优，色泽明、黄，蒙花苷含量高的优良种质。因此，色泽明、黄野菊花药材的绿原酸、木犀草苷含量较高，综合品质优良，外观色泽可用于快速预测野菊花药材内在品质。本研究为色泽评价野菊花品质提供了科学依据和数据支持，为野菊花药材采购及优良品种评价及选育提供了参考。

关键词:野菊花;种质资源;化学成分，色泽;相关性分析;

Germplasm resource evaluation of Chrysanthemi Indici Flos based on color and chemical

components

LI Jian-ing HAN Zheng-zhou CHI Lian-feng

WEI Min

YE Zi WU Man-ting LIN Hong FAN

Guang-hui XU Lei WEI Wei-feng

Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Qinghai University Qinghai Plateau Tree Genetics

and Breeding Laboratory China Resources Sanjiu Medical & Pharmaceutical Co., Ltd.

Shenzhen

Traditional Chinese Medicine Manufacturing Innovation Center Co., Ltd. Medical College of Jiaying

University

Abstract：

This study explored the correlation between color and chemical components of Chrysanthemi Indici Flos (CIF), aiming at providing a reference for its procurement, evaluation, and breeding. Colorimeter and ultra-performance liquid chromatograph (UPLC) were used to determine the color (lightness-shade chromaticity value L*, red-green chromaticity value a*, yellow-blue chromaticity value b*) and chemical components (cynaroside, linarin, luteolin, apigenin, and chlorogenic acid) of 84 CIF germplasms, respectively. Diversity analysis, correlation analysis, regression analysis, and cluster analysis were performed. The results showed that the color and chemical components of CIF were diversified. Chlorogenic acid was in significantly positive correlation with L* and b* and significantly negative correlation with a*. Cynaroside and grey relational grade γi of chemical components were in significantly positive correlation with b* and L*, respectively, whereas linarin, luteolin, and apigenin had no significant correlation with L*, a*, or b*. The 84 CIF germplasms were clustered into 4 clades. In addition, germplasms in clade Ⅲ had higher γi and total color value (E*ab) than those in other clades, with the best quality and color, and a germplasm with the highest quality, bright yellow color, and highest content of linarin was screened out in this clade. Thus, CIF with bright yellow color had high content of cymaroside and chlorogenic acid and thereby high quality. In summary, the color can be used to quickly predict the quality of CIF. Our results provided data for the evaluation of CIF quality by color and a reference for its procurement and breeding.

Keyword：

Chrysanthemi Indici Flos; germplasm resources; chemical components; color; correlation analysis;

野菊花Chrysanthemi Indici Flos为菊科植物Compositae野菊Chrysanthemum indicum L的干燥头状花序，具清热解毒，泻火平肝之功效[1]，是“感冒灵颗粒”“夏桑菊颗粒”“乙肝清热解毒颗粒”等120余种中成药主要原料药材，同时也是2002年卫生部公布的首批“可用于保健食品的物品”，年需求量达数千吨。黄酮类和酚酸类成分是野菊花的主要药效成分，包括木犀草苷、蒙花苷、木犀草素、芹菜素、绿原酸等，具抗菌、消炎、降压、护肝等药理作用[2,3]。蒙花苷是《中国药典》2020年版规定的检测指标性成分，规定质量分数不低于0.8%[1]。野菊为广布种，种质资源丰富，在我国东北、华北、华中、华东、华南及西南地区均有分布，不同地理居群形态特征及内在化学成分均存在较大差异[4,5]。现行版药典记载野菊花头状花序为黄色至棕黄色，但不同产地野菊花药材色泽存在一定差异，除黄色至棕黄色外，还有黄绿色、淡黄色、棕褐色等。色泽鲜亮的野菊花常被用于加工中药饮片、茶饮，其他色泽的野菊花常被用作中成药、配方颗粒原料。

中药材品质评价是制约中药材产业发展的关键环节之一，而外观特征则是评价中药品质的重要指标；中药材外观特征主要包括形态、气味、色泽等，其中色泽是中药材最为直观的外在特征，是中药材“辨状论质”的一项重要指标，在中药材交易过程中被广泛应用于药材品质快速评价[6,7,8]。由于传统视觉鉴别易受主观感知的影响，不同人评价结果不同，而测色仪则可对药材色泽做出量化评价，使得药材色泽评价更为客观，已被用于中药品质评价[9,10]。野菊花药材交易过程中，通常认为色泽黄、亮的野菊花为优质药材，但外观色泽与内在品质的关系并不明确，依据外观色泽评判野菊花内在品质是否具有科学依据有待研究。同时，不同色泽野菊花用途会有不同，其品质是否存在差异有待明确。本研究参照国际照明委员会（CIE）色彩模型，利用测色仪测定野菊花药材色泽（明暗色度值L*、红绿色度值a*和黄蓝色度值b*），利用超高效液相色谱仪（UPLC）测定野菊花中主要化学成分（木犀草苷、蒙花苷、木犀草素、芹菜素、绿原酸）的含量，探究野菊花外观色泽与内在化学成分之间的关系，为野菊花药材品质快速评价及优良品种选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试药材

供试84份野菊花种质由华润三九医药股份有限公司于2014—2020年在国内11个省份收集，种植于湖北省黄石市阳新县华润三九野菊种质资源圃（N 29°55′12″，E 115°3′53″），通过扦插进行无性扩繁。84份种质主要收集自野菊花药材主产区大别山地区，包括安徽、湖北、河南（表1）。

2020年5月10日，将84份野菊种质扦插苗移栽至田间，参考大田种植方式起畦种植，畦宽100 cm，畦高20 cm，畦间距40 cm，每畦种植2列，畦上行间距50 cm，株间距50 cm。采用随机区组设计，3次重复。田间水肥管理等同大田生产。10月下旬—11月下旬，于盛花初期（舌状花展开、管状花部分展开）采集野菊头状花序，60 ℃烘干16 h，粉碎过100目筛。

1.2 对照品及仪器

绿原酸（批号：110753-201314，纯度≥96.6%）、木犀草苷（批号：111720-201609，纯度≥94.9%）、木犀草素（批号：111520-200504，纯度≥99.6%）、蒙花苷（批号：111528-201710，纯度≥96.6%）、芹菜素（批号：111901-201102，纯度≥99.6%）对照品均购自中国食品药品检定研究院。

ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色谱仪（美国Waters公司），YS3060光栅分光测色仪（深圳市三恩时3nh科技有限公司）。

1.3 含量测定

取野菊花药材粉末0.25 g，置具塞锥形瓶，加入100 mL的70%甲醇溶液，加热回流3 h提取，用70%甲醇补足损失质量，0.22 µm微孔滤膜滤过，过滤液待测。参考魏伟锋等[11]多组分定量方法测定野菊花中主要化学成分绿原酸、木犀草苷、木犀草素、蒙花苷、芹菜素的含量。

1.4 色泽测定

取野菊花粉末，装入石英比色皿中压实，使用光栅分光测色仪YS3060（深圳市三恩时3nh科技有限公司）测定明暗色度值L*、红绿色度值a*、黄蓝色度值b*，并计算总色度值E*ab（E∗ab=L*2+a*2+b*2−−−−−−−−−−−−√）。

色度测量条件：起止波长400~700 nm，照明光源D65，10°视角，测量口径8 mm。光栅分光测色仪使用前使用黑白校正板进行校正。

1.5 数据分析

利用Microsoft Office Exel 2019计算5个化学成分的相对关联度γi[12]，以及化学成分、γi和色度值的变异系数CV、Shannon多样性指数H'[13]，对野菊花种质资源遗传多样性进行评价；利用IBM SPSS v21进行Pearson相关性分析、线性回归分析，研究化学成分、γi与色度值间的关系；采用TBtools v1.0983对84份野菊种质γi和E*ab进行Euclidean聚类分析[14]，利用IBM SPSS v21对聚类后的各个类群γi和E*ab进行单因素方差分析（One-Way ANOVA，LSD），利用Microsoft Office Exel 2019计算品质和色泽最优类群的γi、E*ab和蒙花苷含量的隶属函数值μ[15]，筛选优良野菊种质。

2 结果与分析

2.1 野菊花化学成分及色泽多样性分析

84份野菊种质资源的化学成分、综合品质及色泽多样性分析结果见表1。野菊花中5个主要化学成分中蒙花苷平均含量最高（0.99%），其次依次为绿原酸（0.28%）、木犀草苷（0.20%）、木犀草素（0.14%）和芹菜素（0.04%）。野菊花的3个色度值中，L*的范围为53.94~71.31，b*为18.24~39.40，a*为-2.62~5.24，显示野菊花主色调为白色，次色调为黄色，红绿色调最弱，因此E*ab主要受L*和b*影响。

84份野菊花种质化学成分、γi和色度值CV为5.83%~117.00%，H'为3.67~4.43，显示野菊种质资源具丰富的变异及遗传多样性。药典指标性成分蒙花苷含量CV最大、H'最小，L*的CV最小，H'最大，见表2。

2.2 野菊花化学成分及色泽相关性分析

84份野菊花种质的化学成分、γi和色度值相关性分析结果见表3。野菊花中绿原酸含量与L*（r=0.38，P<0.001）、b*（r=0.26，P=0.0142）呈显著正相关，与a*呈负相关（r=-0.31，P=0.004）。木犀草苷含量与b*呈显著正相关（r=0.29，P=0.008）。蒙花苷及芹菜素含量与L*、a*、b*无显著相关性（P>0.05）。野菊花综合品质γi与L*（r=0.32，P=0.003）呈显著正相关。

2.3 野菊花化学成分与色泽回归分析

为进一步研究野菊花化学成分、γi与色泽相关性，采用多元线性回归分析，通过显著性检验筛选对化学成分、γi的影响显著的色度因子。当色度值L*、a*、b*为自变量，绿原酸、木犀草苷、蒙花苷、木犀草素、芹菜素和γi为因变量时，校正R2为0.009~0.135，说明色度值对化学成分的影响程度为0.9%~13.5%，见表4。野菊花化学成分中绿原酸（P<0.001）、木犀草苷（P=0.008）及γi（P=0.003）与药材色泽有显著线性关系，蒙花苷（P=0.182）、木犀草素（P=0.217）、芹菜素（P=0.229）与色泽无显著线性关系，见表5。

野菊花化学成分、γi与色度值间的线性回归方程见表6。方程中回归系数为正数，说明因变量与自变量为正相关；回归系数绝对值越大，因变量对自变量影响程度越大。研究结果显示，野菊花中绿原酸含量、γi随L*增加而增大，木犀草苷含量随b*增加而增大，研究结果与2.2项结果基本一致，因此可通过野菊花外观色泽预测野菊花内在品质。

2.4 基于γi和E*ab的聚类分析

84份野菊种质可聚为4类群，见图1。各类群γi和E*ab比较见图2。第Ⅰ类群共37个种质，占总数的44.0%，此类群为药材品质和色泽适中的野菊种质资源。第Ⅱ类群种质数量占总数的21.4%，γi及E*ab均为最低，显示此类群种质品质和色泽均低于其他类群。第Ⅲ类群共14个种质，γi最大，E*ab较高，该类群品质和色泽均表现优良的野菊种质。第Ⅳ类群γi适中，E*ab最大，为色泽优良、品质适中的类群。

第Ⅲ类群的14个野菊种质品质和色泽均表现优良，采用隶属函数法计算γi、E*ab及蒙花苷含量的累积隶属函数值μ，对14份种质进行综合评价，见表7。结果显示，种质AHTC-201902的u最大，表现为品质及色泽优良，蒙花苷含量高，其次为种质SNQ-201901。

3 讨论

本研究测定了84份野菊花样品中5种活性成分含量及其色度值，研究结果显示，野菊花色泽与绿原酸、木犀草苷及其综合品质γi存在显著相关性，与蒙花苷、木犀草素、芹菜素无显著相关性；色度值对化学成分有一定影响，可根据药材色泽预测绿原酸、木犀草苷的含量高低，以及综合品质的优劣。因此，野菊花药材色泽越亮，绿原酸和综合品质越高，色泽越黄，木犀草苷含量越高，但无法通过色泽预测蒙花苷、木犀草素、芹菜素含量。在野菊花药材采购及优良品种选育过程中，色泽可作为药材品质的评判依据之一。色泽作为中药材品质评价的一项重要且简单易行指标，已被广泛应用于药材品质快速评价[6,8,16]。已有研究结果显示，色泽亮、红的西红花，西红花苷 Ⅰ、西红花苷 Ⅱ含量通常较高[17]；色泽亮、黄的黄柏，小檗碱及黄柏碱含量通常较高[18]；色泽黑、蓝的三七粉末，三七皂苷总含量通常较高[19]。

中药材是复杂多组分体系，其疗效的发挥是多成分协同作用的结果，单一活性成分难以客观反应中药材品质，中药材综合品质如何评价已成为中医药的重大科学难题[20]。灰色关联度分析法（grey relational analysis，GRA）是将灰色系统中各指标进行综合描述和量化评估的一种方法，可以对其系统指标进行全面、客观的评价，克服了依靠单一指标评价事物优劣的弊端[21]，已被用于柴胡[22]、党参[23]、当归[24]、黄蜀葵花[25]等中药材品质评价。本研究引入灰色关联度分析法结合5个活性成分对84份野菊花种质资源评品质进行了综合评价和排序，避免了依靠单一蒙花苷含量片面评价野菊花药材品质。

野菊为广布种，在我国大部分地区均有分布，通常认为大别山区为野菊花传统产区[26]。聚类结果显示，色泽和品质优良的第Ⅲ类群共14个野菊种质，源自安徽、湖北、河南、陕西、山西，并无明显地域性，即道地性不明显，与韩正洲等[27]、魏民等[28]研究结果一致。野菊种质资源化学成分及色泽变异大且遗传多样，开展野菊种质资源评价进而选育优良种质，对于保障野菊花相关产品品质具有重要意义。本研究通过聚类分析，从84份野菊种质中筛选出1个色泽黄亮，品质优良，且蒙花苷含量高于药典标准的野菊种质，可重点培育用于开发野菊花精致饮片、野菊花茶饮等产品。

本研究通过相关性分析和回归分析解析了野菊花化学成分与色泽之间的关系，通过聚类分析筛选出色泽和品质均表现优良的种质，为野菊花药材品质快速评价及优良品种快速发掘提供了参考依据。本研究供试野菊花样品采收期及加工方式均保持一致，但采收期、加工方式、储藏时间不同，野菊花色泽会有变化，不同条件下野菊花药材外观色泽及内在化学成分的影响有待研究。

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